如何使用简单的实验方法检测DNA纯度

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DNA的OD值测定260280大于1.80,说明没有RNA没有污染吧,可是为什么跑电泳之后最下面还有一条明亮的条带

如何使用简单的实验方法检测DNA纯度

丙肝病毒含量HCV-RNA从8.87E 003变到1.80E 004是高了还是低了,怎么计算的

DNA的OD值测定260280大于1.80,说明没有RNA没有污染吧,可是为什么跑电泳之后最下面还有一条明亮的条带

检测的话对于RNA污染是非常不准确的,因为RNA的260/280大概也是那附近,约为1.8-2.0左右。

所以这种检测方法仅仅能测定是否有蛋白质的污染。

一般提取DNA的过程中,RNA污染几乎是不能避免的,尤其是用某些生长旺盛的组织提取DNA,这些组织往往RNA的表达量都非常大。

所以电泳时能够看到RNA的部分。

但一般RNA对后续的操作影响并不是很大,所以很多时候都可以不用管它。

如果实在看它不顺眼,你可以在提取完成后加入Rnase去消化它。

如何使用简单的实验方法检测DNA纯度

实验原理

DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处。

因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。

如用25px光径,用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:

DNA(ug/ml)=50×OD260读数×稀释倍数。

RNA(ug/ml)=40×OD260读数×稀释倍数。

DNA/RNA纯品的OD260/OD280为1.8或2.0,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。

若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在。

OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间,若比值较高说明有残余的盐存在.本实验室机器显示是OD260\OD230,则比值应在2-2.5之间,偏小则说明有残余盐剩余。

实验步骤

1.将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中[pH8.O,1Ommo1/L的Tris缓冲液,内含〈1mmol/LEDTA〉]或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。

2.用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线,测定OD260和OD280,并计算比值:OD260/OD280,纯DNA的此比值约为1.8~2.0。

纯RNA的此比值约为大于2.0。

3.根据:每毫升1微克的纯DNA的OD260值=0.020,计算所得DNA的纯度;

每毫升1微克的纯RNA的OD260值=0.025,计算所得RNA的纯度;

并讨论纯度较低的原因和解决办法。

260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白等有机物的值。

一般的,只看OD260/OD280(Ratio,R)。

DNA:OD260/OD280比值应接近1.80,若R值大于1.8。

说明存在RNA,可重新用RNaseA处理,酚:氯仿:异戊醇(23:24:1)抽提。

若R值小于1.8,则说明有蛋白质等杂质存在,需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、异戊醇重新对DNA进行纯化(也可加入1/8体积的3MNaAc(pH5.2)与冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。

RNA:OD260/OD280比值在1.8-2.0时,认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的,不过要注意,当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时,R值可能会大于2(一般应该是

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